Perbedaan antara sekuensing Sanger dan pyrosequencing

Perbedaan utama - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
 

Urutan DNA sangat penting untuk analisis DNA karena pengetahuan tentang pengaturan nukleotida yang benar pada wilayah DNA tertentu mengungkapkan banyak informasi penting tentang hal itu. Ada metode sekuensing DNA yang berbeda. Sanger Sequencing dan Pyrosequencing adalah dua metode sekuensing DNA yang berbeda secara luas digunakan dalam biologi molekuler. Perbedaan utama antara sekuensing Sanger dan pirosequencing adalah bahwa Sanger Sequencing menggunakan dideoxynucleotides untuk menghentikan sintesis DNA untuk membaca urutan nukleotida sementara pirosequencing mendeteksi pelepasan pirofosfat dengan memasukkan nukleotida dan mensintesis urutan komplementer untuk membaca urutan yang tepat.

ISI
1. Ikhtisar dan Perbedaan Utama
2. Apa sekuensing Sanger
3. Apa itu Pyrosequencing
4. Perbandingan berdampingan - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
5. Ringkasan

Apa sekuensing Sanger?

Sanger Sequencing adalah metode sekuensing DNA generasi pertama yang dikembangkan oleh Frederick Sanger dan perguruan tingginya pada tahun 1977. Itu juga dikenal sebagai Sequencing terminasi rantai atau Sequencing Dideoxy Karena didasarkan pada penghentian rantai oleh Dideoxynucleotides (DDNTPS). Metode ini banyak digunakan selama lebih dari 30 tahun hingga Sequencing Generasi Baru (NGS) dikembangkan. Teknik Sequencing Sanger memungkinkan penemuan urutan nukleotida yang benar atau perlekatan fragmen DNA tertentu. Ini didasarkan pada penggabungan selektif DDNTPS dan penghentian sintesis DNA selama in vitro Replikasi DNA. Tidak adanya kelompok 3 'OH untuk melanjutkan pembentukan ikatan fosfodiester antara nukleotida yang berdekatan adalah fitur unik dari DDNTPS. Oleh karena itu, begitu DDNTP terpasang, perpanjangan rantai berhenti dan berakhir sejak saat itu. Ada empat ddntps - ddatp, ddctp, ddgtp dan ddttp - digunakan dalam sekuensing sanger. Nukleotida ini menghentikan proses replikasi DNA ketika mereka dimasukkan ke dalam untaian DNA yang tumbuh dan menghasilkan berbagai panjang DNA pendek. Elektroforesis gel kapiler digunakan untuk mengatur untaian DNA pendek ini dengan ukurannya pada gel seperti yang ditunjukkan pada Gambar 01.

Gambar 1: Elektroforesis gel kapiler dari DNA pendek yang disintesis

Untuk in vitro replikasi DNA, beberapa persyaratan harus disediakan. Mereka adalah enzim DNA polimerase, Templat DNA, primer oligonukleotida, dan deoxynucleotides (DNTP). Dalam sekuensing Sanger, replikasi DNA dilakukan dalam empat tabung reaksi terpisah bersama dengan empat jenis DDNTPS secara terpisah. Deoxynucleotides tidak sepenuhnya digantikan oleh masing -masing ddntps. Campuran DNTP tertentu (misalnya; DATP + DDATP) termasuk dalam tabung dan direplikasi. Empat produk tabung terpisah dijalankan pada gel dalam empat sumur terpisah. Kemudian dengan membaca gel, urutan dapat dibangun seperti yang ditunjukkan pada Gambar 02.

Gambar 02: Urutan Sanger

Sanger Sequencing adalah teknik penting yang membantu di banyak bidang biologi molekuler. Proyek Genom Manusia berhasil diselesaikan dengan bantuan metode berbasis sekuensing Sanger. Sanger Sequencing juga berguna dalam sekuensing DNA target, penelitian kanker dan penyakit genetik, analisis ekspresi gen, identifikasi manusia, deteksi patogen, sekuensing mikroba dll.

Ada beberapa kelemahan dari sekuensing Sanger:

• Panjang DNA yang diurutkan tidak boleh lebih dari 1000 pasangan basa
• Hanya satu untai yang dapat diurutkan sekaligus.
• Prosesnya memakan waktu dan mahal.

Oleh karena itu, teknik sekuensing canggih baru dikembangkan dengan waktu untuk mengatasi masalah ini. Namun, sekuensing Sanger masih digunakan karena hasilnya yang sangat akurat hingga sekitar 850 fragmen panjang pasangan basa.

Apa itu Pyrosequencing?

Pyrosequencing adalah teknik sekuensing DNA baru berdasarkan "Sequencing by Sintesis". Teknik ini bergantung pada deteksi pelepasan pirofosfat pada penggabungan nukleotida. Proses ini digunakan oleh empat enzim yang berbeda: DNA polymerse, ATP sulfurylase, luciferase dan apyrase dan dua substrat adenosin 5 'fosfosulfat (APS) dan luciferin.

Prosesnya dimulai dengan ikatan primer dengan templat DNA untai tunggal dan DNA polimerase memulai penggabungan nukleotida yang saling melengkapi. Saat nukleotida bergabung bersama (polimerisasi asam nukleat), ia melepaskan pirofosfat (dua gugus fosfat yang terikat bersama) dan energi dan energi. Setiap penambahan nukleotida melepaskan kuantitas pirofosfat yang sama. Pirofosfat dikonversi menjadi ATP oleh ATP sulfurylase di hadapan AP substrat. ATP yang dihasilkan mendorong konversi luciferin yang dimediasi luciferase menjadi oxyluciferin, menghasilkan cahaya yang terlihat dalam jumlah yang sebanding dengan jumlah ATP. Cahaya dideteksi oleh perangkat deteksi foton atau dengan photomultiplier dan membuat pirogram. Apyrase menurunkan ATP dan DNTP yang tidak terhubung dalam campuran reaksi. Penambahan DNTP dilakukan sekali. Karena penambahan nukleotida diketahui sesuai dengan penggabungan dan deteksi cahaya, urutan templat dapat ditentukan. Pyrogram digunakan untuk menghasilkan urutan nukleotida dari DNA sampel seperti yang ditunjukkan pada Gambar 03.

Pyrosequencing sangat penting dalam analisis polimorfisme nukleotida tunggal dan sekuensing bentangan pendek DNA. Akurasi tinggi, fleksibilitas, kemudahan otomatisasi, dan pemrosesan paralel adalah keuntungan dari pyrosequencing dibandingkan teknik sekuensing Sanger.

Gambar 03: Pyrosequencing

Apa perbedaan antara sekuensing Sanger dan pirosequencing?

Ringkasan -Sanger Sequencing vs Pyrosequencing

Sanger Sequencing dan Pyrosequencing adalah dua metode sekuensing DNA yang digunakan dalam biologi molekuler. Sanger Sequencing Membangun urutan nukleotida secara berurutan dengan mengakhiri perpanjangan rantai sementara pirosequencing membangun urutan yang tepat dari nukleotida secara berurutan dengan memasukkan nukleotida dan mendeteksi pelepasan pirofosfat. Oleh karena itu, perbedaan utama antara sekuensing Sanger dan pyrosequencing adalah bahwa sekuensing Sanger bekerja pada pengurutan berdasarkan terminasi rantai sementara pyrosequencing bekerja pada pengurutan dengan sintesis.

Referensi:
1. Fakruddin, MD, dan Abhijit Chowdhury. “Pyrosequencing-Alternatif untuk Sequencing Sanger Tradisional.”American Journal of Biokimia dan Bioteknologi. Publikasi Sains, 02 Mar. 2012. Web. 28 Feb. 2017.
2. “Urutan Sanger.”Sanger Sequencing - Topik ScienceDirect. N.P., N.D. Web. 28 Feb. 2017

Gambar milik:
1. “Didesoxy -Methode” oleh Christoph Goemans (Modifiziert) - DR. Norman Mauder, auf basis einer dateI von christoph goemans (cc by-sa 3.0) Via Commons Wikimedia
2. "Sanger-DNA-Seq" oleh Enzo di Wikipedia Bahasa Polandia (CC BY-SA 3.0) Via Commons Wikimedia
3. "Pyrosequencing" oleh Microbiologybytes (CC BY-SA 2.0) Via Flickr